掃描電鏡樣品的干燥
樣品的制備中，干燥是最關(guān)鍵的步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化，這對掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透(因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶)。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水，從而使干燥過程對樣品表面產(chǎn)生的影響較少。然后就是如何設(shè)法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點干燥法、冰凍干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等。 空氣干燥法： 空氣干燥法又稱自然干燥法，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。此法的最大優(yōu)點是簡單易行和節(jié)省時間，它的致命缺點是在干燥過程中，組織會因脫水劑揮發(fā)時表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，此種方法一般只適用于外殼(表面)較為堅硬的樣品。 在采用空氣干燥時，為了減少樣品的收縮變形，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇、丙酮等外，還應(yīng)使樣品得到充分固定，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好。因為它會使組織變得較為堅硬，使收縮變形減少。 然而，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時可以通過收縮使細(xì)胞之間相互剝離，從而能清楚地觀察到一個個單獨存在的細(xì)胞及其表面結(jié)構(gòu)。此外，還可通過細(xì)胞成份在干燥時的收縮，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線粒體、細(xì)胞核等成份的存在。但這種機(jī)會很少，而且因收縮帶來的不利是主要的，所以，目前很少采用。 臨界點干燥法： 臨界點干燥法是一種消除了物相界面(液相／氣相)，也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方法由于沒有表面張力的影響，所以樣品不易收縮和損傷，此法所用的儀器結(jié)構(gòu)不甚復(fù)雜，操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2h左右即可完成，所以，是最為常用的方法。 物質(zhì)的臨界點是1822年由Charles cagridde La Tour發(fā)現(xiàn)的。他將不同的液體分別裝進(jìn)玻璃試管并密封起來，然后一邊轉(zhuǎn)動一邊加熱，這時，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月面開始變得模糊起來，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現(xiàn)。每種液體都存在某一溫度，在這一溫度時，液相的彎月面完全消失。 那么，彎月面的消失意味著什么呢?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，是因為在密封的容器里，液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下，液體由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體，原先存在它們之間的彎月面(即液面)就消失了，表面張力也自然消失了。因此，所謂臨界點，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和液態(tài)兩相之間達(dá)到相同密度，成為均一流體狀態(tài)時的溫度和壓力的總稱。此時的溫度稱臨界溫度；此時的壓力稱臨界壓力。 不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點，一般用于掃描電鏡樣品臨界點干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表10-1。如果在臨介點進(jìn)行干燥，由于表面張力消失就不會造成樣品表面的損傷。但進(jìn)行臨界點干燥，需用專用的臨界點干燥器。具體處理步驟如下： 固定脫水 按透射電鏡常規(guī)制樣方法進(jìn)行。 純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100％后，用純丙酮置換15～20min。 中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后,用醋酸異戊酯(乙酸異戊B8)處理15-80min(也可以過夜)置換丙酶。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中。 裝樣： 將樣品從醋酸異戊酯中挑入(或倒入)樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯(高壓容器)內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。(注：在裝樣前，應(yīng)先打開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0℃處預(yù)冷10～15min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中)。注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在0～10℃下，向樣品杯注入液體二氧化碳。 漂洗： 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50％(通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度)時，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置15～20min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后，打開儀器排氣流量計閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液10min左右，(讓含有醋酸異戊酯的二氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳)再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的80％左右，關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液。 加溫置換： 將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20℃處經(jīng)15～20min后，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐漸氣化，因此，壓力也隨之上升至7000Pa左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置換。 氣化： 將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上(35～40℃)，此時隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸增加，達(dá)到二氧化碳的臨介點，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到7134Pa時，經(jīng)5min后，即可排氣。 排氣 在保持溫度不變的條件下(即不關(guān)電源)，打開流量計的排氣閥門，以1.0～1.51／min的速度排氣(速度慢些更好)。約經(jīng)45～60min后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫度調(diào)節(jié)至室溫約5rain后，即可取出樣品裝臺鍍膜(若不能立即裝臺，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存)。 臨界點干燥的成敗如何；與每一步的操作有很大關(guān)系，因此，操作時應(yīng)注意以下事項： 在樣品放進(jìn)樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至0～10℃，因為溫度過高，充入的液體二氧化碳會立即氣化膨脹，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼續(xù)進(jìn)入樣品杯。 樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時送入樣品杯。因為過濕表明乙酸異戊脂太多會干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會因空氣干燥而造成樣品己變形，再進(jìn)行臨介點干燥也沒有意義了。 一次加入的樣品不宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點。 充入液體二氧化碳的量要足。因為充液量不足，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點干燥作用，一般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的2/3左右。 在加溫氣化時，實際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài)。 "開"、"閉"閥門時，動作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或濾紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時間應(yīng)在．4Omin以上，有時也可以放氣過夜或過中午。 二氧化碳臨界點干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳(干冰)作干燥介質(zhì)的。與液體二氧化碳比較，固體二氧化碳有以下優(yōu)點: 有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞，若用液體二氧化碳干燥，由于二氧化碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒有這種危險。 不需要用鋼瓶，鋼瓶很重，搬運麻煩；用固體二氧化碳時，有適當(dāng)大小的保溫瓶(如冰壺)就可以了，因此很方便。 能保證二氧化碳裝滿樣品室，即使用固體二氧化碳時，每次都能準(zhǔn)確地放入足夠酌量，而不會像使用液體二氧化碳時由于鋼瓶中二氧化碳不足，充不進(jìn)樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而造成損傷。 夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進(jìn)入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響，即無論多熱的天氣也能放進(jìn)足夠量。 不污染樣品 使用液體時，往往由于鋼瓶內(nèi)有鐵銹粉末充進(jìn)樣品杯而污染樣品，而固體二氧化碳則無此種污染。 固體二氧化碳臨界點干燥法除使用專門裝置外，也可用任何一種液體臨界點干燥器，不過由于液體臨界點干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點干燥法的樣品處理{固定、脫水等)與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時的具體操作。其操作步驟是：先將干冰用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體(也可敲成碎塊或粉末)，放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋，然后加熱到15℃，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時干燥器內(nèi)的壓力上升，再加熱到40C，使液體二氧化碳逐漸氣化，壓力繼續(xù)上升達(dá)到臨界值，幾分鐘后即可排氣(溫度不變)。當(dāng)氣體全部排出，壓力回到零后，即取出樣品，裝臺鍍膜觀察。 冰凍干燥法： 冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過升華，除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冰凍干燥的基礎(chǔ)是冰(或固態(tài)溶劑)從樣品中升華，也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過中間的液態(tài),不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，因此，能較好地避免或減少了在干燥過程中對樣品的損傷。冰凍干燥方法有兩種，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機(jī)溶劑中冰凍干燥。 含水樣品直接冰凍干燥法: 此法相對于臨界點干燥有其明顯優(yōu)點，即能直接使含水樣品冰凍干燥，不需要用有機(jī)溶劑脫水和置換，避免了無極性溶劑對樣品成份的抽提作用，因此，不會使樣品收縮和膜結(jié)構(gòu)或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài)，從而得到好的實驗樣品。 含水樣品冰凍干燥的步驟如下： 取材固定，按常規(guī)方法進(jìn)行。 冰凍保護(hù)劑滲透 將樣品置于10％～20％的二甲基亞砜(DWSO)水溶液或15％～40％的甘油水溶液，或氯仿中浸泡數(shù)小時。 驟冷 將經(jīng)保護(hù)劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預(yù)冷到一150℃的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中，使樣品中的水分在片刻間凍結(jié)。 升華干燥 將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺上(保持一70C以下),抽真空(真空度為10～10-1Pa)，經(jīng)幾小時或數(shù)天后，樣品即達(dá)到干燥； 裝臺鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺加熱至室溫，然后將干燥器放氣，取出樣品迅速裝臺粘樣，送入鍍膜儀中鍍膜。 但是這種方法也有其不足之處，就是干燥時間太長，如單層細(xì)胞也要幾小時才能達(dá)到干燥，而幾毫米厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天，同時要判斷是否干燥也較為困難，冰凍過程中會形成冰晶，使細(xì)胞成份因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形，造成人為的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此必須采取一些防止這一不良情況產(chǎn)生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度。 為了防止冰晶的形成，可采用以下辦法：①用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22；此外，液態(tài)一固態(tài)氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210℃，因此可作為驟冷劑；②用冷凍保護(hù)劑如二甲基亞砜、甘油、明膠或氯仿處理樣品，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小，以保護(hù)樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好，因為氯仿易于揮發(fā)，不留在樣品表面而影響觀察。此外，透射電鏡冰凍制樣技術(shù)中的冷凍方法，也適用于掃描電鏡。 樣品脫水后的冰凍干燥: 這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達(dá)到樣品干燥的；這種方法相對于前一種方法有下列優(yōu)點；即有機(jī)溶劑在冰凍時形成非晶體固態(tài)，不像水那樣結(jié)冰時膨脹，因此不會產(chǎn)生冰晶對樣品的損傷。有機(jī)溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華，因此，干燥時間比上一方法短得多，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品臺即可。但此法也有不足之處，就是有機(jī)溶劑對樣品成份有抽提作用，易造成部分內(nèi)含物丟失。 此法的操作程序與前法基本相同，只是無需用冷凍保護(hù)劑處理而已。現(xiàn)將幾種方法介紹如下： 氟利昂TF冷凍干燥法： 固定脫水按常規(guī)方法進(jìn)行。、 置換： 按圖中所示的比例配好氟利昂TF和酒精混合液，并通過這些混合液將樣品逐步引入100％氟利昂TF。 冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍。 干燥 將樣品放在預(yù)先冷卻的鋁座上，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa)，經(jīng)0～20min后即完全干燥。90min后鋁座變?yōu)槭覝兀慈〕鰳悠贰⒀b臺、鍍膜觀察。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法： 這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時會冷卻固化這一性質(zhì)，將樣品干燥的很獨特的方法。其操作步驟如下： 固定、水洗按常規(guī)方法進(jìn)行。 脫水 使用上升的系列乙腈(50％～100％)脫水各20min。 滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈，并投入樣品。 升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空，此時由于乙腈急速蒸發(fā)而使容器急劇冷卻，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使乙腈升華， 約經(jīng)30min，樣品即達(dá)干燥。 待容器回升到室溫后，即可取出樣品裝臺鍍膜進(jìn)行觀察。 據(jù)田中敬一報道此法干燥的效果與臨界點干燥沒有什么不同。 茨烯干燥法 莰烯是一種樟腦類無色結(jié)晶體，能溶于醚、環(huán)乙烷、環(huán)己烯和氯仿中，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華，從固態(tài)直接變成氣態(tài)，表面張力小，故經(jīng)它干燥的樣品較松軟，變形小，操作也較簡便。 莰烯干燥法是由Warrens．Buk于1971年提出的，其操作步驟如下： 取新鮮材料迅速投入0．1mol/L磷酸緩沖液中漂洗，然后投入5％的戊二醛(用磷酸緩沖液配制的pH7.4)中固定1h。 轉(zhuǎn)至加有5.4％蔗糖的0．1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過夜。 用l％的四氧化鋨(磷酸緩沖液配制)溶液中固定2h。 用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗2～3次，每次、15min。 用30％，50％，70％，90％，95％和100％丙酮脫水，每級15min。 用100％的苯脫酯。 在1：1苯與環(huán)氧丙烷中浸泡15min，再轉(zhuǎn)至純環(huán)氧丙烷中，在45℃下經(jīng)20min后，轉(zhuǎn)入預(yù)先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透，取出樣品裝臺。 放入真空干燥器中，在室溫下抽真空1h左右，使莰烯直接從固體中升華，然后鍍膜。
