掃描電鏡生物樣品的制樣技術(shù)
大多數(shù)生物樣品都含有水分，而且比較柔軟，因此，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前，要對(duì)樣品作相應(yīng)的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結(jié)構(gòu)保存好，沒(méi)有變形和污染，樣品干燥并且有良好導(dǎo)電性能。 一．樣品的初步處理 (一) 取材 樣品面積可為8mm×8mm，厚度可為5mm。對(duì)于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組織表面。 (二) 樣品的清洗 用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由于樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會(huì)遮蓋樣品的表面結(jié)構(gòu)，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種： 1．用等滲的生理鹽水或緩沖液清洗； 2．用5%的蘇打水清洗； 3．用超聲震蕩或酶消化的方法進(jìn)行處理。例如清洗腸粘膜表面的粘液，可用下面的方法： 清洗液配方：透明質(zhì)酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理鹽水 100 ml清洗液的pH為5.5～6。 清洗的方法是將樣品浸泡在配好的清洗液中，邊浸泡邊震蕩30分鐘，最后用雙蒸水洗3次。無(wú)論用哪種清洗方法，注意在清洗時(shí)不要損傷樣品。 (三) 固定 固定樣品的常用試劑為戊二醛及鋨酸雙固定。由于樣品體積較大，固定時(shí)間應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)。也可用快速冷凍固定。 (四) 脫水 樣品經(jīng)漂洗后用逐級(jí)增高濃度的酒精或丙酮脫水，然后進(jìn)入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。 二．樣品的干燥 掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進(jìn)行。無(wú)論是水或脫水溶液，在高真空中都會(huì)產(chǎn)生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會(huì)破壞樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進(jìn)行干燥。干燥的方法有以下幾種： (一) 空氣干燥法 空氣干燥法又稱(chēng)自然干燥法，就是將經(jīng)過(guò)脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。這種方法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行和節(jié)省時(shí)間；它的主要缺點(diǎn)是在干燥過(guò)程中，組織會(huì)由于脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，該方法一般只適用于表面較為堅(jiān)硬的樣品。 (二) 臨界點(diǎn)干燥法 臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)時(shí)，其表面張力等于零的特性，使樣品的液體完全汽化，并以氣體方式排掉，來(lái)達(dá)到完全干燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細(xì)結(jié)構(gòu)。此法操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長(zhǎng)，一般約2～3小時(shí)即可完成，所以是最為常用的干燥方法。但用此法，需要特殊儀器設(shè)備。臨界點(diǎn)干燥是在臨界點(diǎn)干燥儀中進(jìn)行的，操作步驟如下： 1．固定、脫水：按常規(guī)方法進(jìn)行。如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100%后，要用純丙酮置換15～20分鐘。 2．轉(zhuǎn)入中間液：由純丙酮轉(zhuǎn)入中間液醋酸異戊酯中，時(shí)間約15～30分鐘。 3．移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒，然后移至臨界點(diǎn)干燥儀的樣品室內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。 4．用液體二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達(dá)到臨界狀態(tài)(31(C , 72.8大氣壓)后，將溫度再升高10(C，使液體二氧化碳?xì)饣缓蟠蜷_(kāi)放氣閥門(mén)，逐漸排出氣體，樣品即完全干燥。 (三) 冷凍干燥法 冷凍干燥法是將經(jīng)過(guò)冷凍的樣品置于高真空中，通過(guò)升華除去樣品中的水分或脫水劑的過(guò)程。冷凍干燥的基礎(chǔ)是冰從樣品中升華，即水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過(guò)中間的液態(tài)，不存在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用，從而減輕在干燥過(guò)程中對(duì)樣品的損傷。冷凍干燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍干燥和樣品脫水后冷凍干燥。 1．含水樣品直接冷凍干燥法 1.1 取材固定：按常規(guī)方法進(jìn)行。 1.2 置于冷凍保護(hù)劑中：將樣品置于冷凍保護(hù)劑中浸泡數(shù)小時(shí)。常用的冷凍保護(hù)劑為10%～20%二甲基亞砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。 1.3 驟冷：將經(jīng)過(guò)保護(hù)劑處理的樣品迅速投入用液氮預(yù)冷至(150(C的氟利昂冷凍劑中，使樣品中的水分很快凍結(jié)。 1.4 干燥：將已凍結(jié)的樣品移到冷凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣品臺(tái)上，抽真空，經(jīng)幾小時(shí)或數(shù)天后，樣品即達(dá)到干燥。 本方法不需要脫水，避免了有機(jī)溶劑對(duì)樣品成分的抽提作用，不會(huì)使樣品收縮，也是較早使用的方法。但是，由于花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，消耗液氮多，容易產(chǎn)生冰晶損傷，因此未被廣泛應(yīng)用。 2．樣品脫水后冷凍干燥 樣品用乙醇或丙酮脫水后過(guò)渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，然后連同這些溶劑一起冷凍并在真空中升華而達(dá)到干燥。和前一種方法比較，本方法的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)產(chǎn)生冰晶損傷，且干燥時(shí)間短。不足之處是有機(jī)溶劑對(duì)樣品成分有抽提作用，造成部分內(nèi)含物丟失。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時(shí)會(huì)冷卻固化的性質(zhì)將樣品干燥的方法。其操作步驟如下： (1) 固定、水洗：按常規(guī)方法進(jìn)行。 (2) 乙腈置換：分別使用50%、70%、80%、90%的乙腈水溶液置換，最后用100%乙腈代替，每步驟15～20分鐘。 (3) 干燥：至純乙腈時(shí)，放入真空鍍膜臺(tái)抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(jié)(凍結(jié)的溫度為(45(C)，變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使凍結(jié)的乙腈升華，約需30分鐘，樣品即達(dá)干燥。 樣品干燥后要粘在樣品臺(tái)上。對(duì)于不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導(dǎo)電膠來(lái)粘固；對(duì)于要鍍膜的樣品，則可以用膠水或萬(wàn)能膠來(lái)代替，微細(xì)的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來(lái)粘貼。 三．樣品的導(dǎo)電處理 生物樣品經(jīng)過(guò)脫水、干燥處理后，其表面不帶電，導(dǎo)電性能也差。用掃描電鏡觀察時(shí)，當(dāng)入射電子束打到樣品上，會(huì)在樣品表面產(chǎn)生電荷的積累，形成充電和放電效應(yīng)，影響對(duì)圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進(jìn)行導(dǎo)電處理，使樣品表面導(dǎo)電。常用的導(dǎo)電方法有以下幾種： (一) 金屬鍍膜法 金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發(fā)后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后，不僅可以防止充電、放電效應(yīng)，還可以減少電子束對(duì)樣品的損傷作用，增加二次電子的產(chǎn)生率，獲得良好的圖象。 1．真空鍍膜法 真空鍍膜法是利用真空鍍膜儀進(jìn)行的。其原理是在高真空狀態(tài)下把所要噴鍍的金屬加熱，當(dāng)加熱到熔點(diǎn)以上時(shí)，會(huì)蒸發(fā)成極細(xì)小的顆粒噴射到樣品上，在樣品表面形成一層金屬膜，使樣品導(dǎo)電。噴鍍用的金屬材料應(yīng)選擇熔點(diǎn)低、化學(xué)性能穩(wěn)定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產(chǎn)生率、膜本身沒(méi)有結(jié)構(gòu)。現(xiàn)在一般選用金或金和碳。為了獲得細(xì)的顆粒，有用鉑或用金—鈀、鉑—鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm～20nm。真空鍍膜法所形成的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復(fù)雜并且費(fèi)時(shí)，目前已經(jīng)較少使用。 2．離子濺射鍍膜法 在低真空(0.1～0.01乇)狀態(tài)下，在陽(yáng)極與陰極兩個(gè)電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時(shí)，電極之間會(huì)產(chǎn)生輝光放電。在放電的過(guò)程中，氣體分子被電離成帶正電的陽(yáng)離子和帶負(fù)電的電子，并在電場(chǎng)的作用下，陽(yáng)離子被加速跑向陰極，而電子被加速跑向陽(yáng)極。如果陰極用金屬作為電極(常稱(chēng)靶極)，那么在陽(yáng)離子沖擊其表面時(shí)，就會(huì)將其表面的金屬粒子打出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為濺射。此時(shí)被濺射的金屬粒子是中性，即不受電場(chǎng)的作用，而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面，被濺射的金屬粒子就會(huì)落到樣品表面，形成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜，稱(chēng)為離子濺射鍍膜法。 和真空鍍膜法比較，離子濺射鍍膜法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)由于從陰極上飛濺出來(lái)的金屬粒子的方向是不一致的，因而金屬粒子能夠進(jìn)入到樣品表面的縫隙和凹陷處，使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜，對(duì)于表面凹凸不平的樣品，也能形成很好的金屬膜，且顆粒較細(xì)。(2)受輻射熱影響較小，對(duì)樣品的損傷小。(3)消耗金屬少。(4)所需真空度低，節(jié)省時(shí)間。） (二) 組織導(dǎo)電法 用金屬鍍膜法使樣品表面導(dǎo)電，需要特殊的設(shè)備，操作比較復(fù)雜，同時(shí)對(duì)樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人采用組織導(dǎo)電法(又稱(chēng)導(dǎo)電染色法)，即利用某些金屬 溶液對(duì)生物樣品中的蛋白質(zhì)?脂類(lèi)和醣類(lèi)等成分的結(jié)合作用，使樣品表面離子化或產(chǎn)生導(dǎo)電性能好的金屬鹽類(lèi)化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導(dǎo)電率。此法的基本處理過(guò)程是將經(jīng)過(guò)固定、清洗的樣品，用特殊的試劑處理后即可觀察。由于不經(jīng)過(guò)金屬鍍膜，所以不僅能節(jié)省時(shí)間，而且可以提高分辨率，還具有堅(jiān)韌組織，加強(qiáng)固定效果的作用。組織導(dǎo)電法主要有碘化鉀導(dǎo)電染色法、碘化鉀--醋酸鉛導(dǎo)電法、丹寧酸—鋨酸導(dǎo)電法等。比較常用的是丹寧酸—鋨酸導(dǎo)電法，其具體操作方法如下： (1)樣品處理：按常規(guī)方法取材、清洗及用戊二醛固定。 (2)導(dǎo)電染色：將樣品放入2%～4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結(jié)構(gòu)，浸泡時(shí)間為30分鐘；如果觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)，浸泡時(shí)間為8小時(shí)，即可過(guò)夜。在浸泡過(guò)程中，可更換一次溶液。 (3)清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗，然后放入1%鋨酸中固定2～4小時(shí)，再用磷酸緩沖液清洗。 (4)脫水和干燥：按常規(guī)方法。 (5)掃描電鏡觀察
